红外线灭菌器的六大特点

关于酶切的有用知识-红外线灭菌器技术文章酶切是分子生物学中常用的,如何选择酶切缓冲液,提高酶切效率,是一个十分关键的问题,本人摘用了其它论坛的内容,另外将逐步整理,使酶切问题能够比较容易解决,希望大家补充:PCR产物的酶切。PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系,所以设计引物的时候就应该注意到这一点,如何选择保护碱基,具体参见NEB上关于保护碱基的资料红外线灭菌器:2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题,切不动可以从以下方面考虑:(1)酶切缓冲液、每种酶都有公司提供的zui佳缓冲液,它们的差别只是离子浓度与体系的不同,如Na、k、Mg等,还有PH值及缓冲体系(一般Tris-HCl),另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液,要达到高酶切效率,选择是个问题,如果酶切时间和量足够,解决的方法:(A)使用其中一个酶的缓冲液,但要考虑到另一酶的反应效率,反应效率如何,可以查查酶在不同buffer里的效率参数,具体见公司,如NEB提供了很好的buffer参数:(B)使用它们的通用的缓冲液,使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率;没有通用的BUFFER怎么办呢?分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐,这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到zui大的酶切效率,但缺点是要回收,损失大 ;(C)克隆到T载体中,值得推荐的方法,克隆到T载体中,不须要考虑受这个条件的限制,酶切位点也可以用T载体上自带的。2)酶切温度。酶切温度也很重要,一般的酶切zui适温度为37度,有些特殊的酶的反应温度不同,如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下zui好分开切,先低温后高温(3)酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全,一般为1-3h,这个时间已经足够,对于一些活性较好的酶,30min就可以酶切完全,建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率;PCR产物的酶切时间较长,一般24小时。(4)酶失活。如果使用酶解冻后放置太久,可能导致酶失活。这种情况较少见,只能换新酶。如果拿了不同公司的酶,buffer也不一样,怎么办?放心,可以用不同公司的酶进行双酶切,一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比,选择它们都有适中活性的buffer,每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是zui合适的!(5)酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度,在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图,尤其插入的是小片段DNA,酶切后产物量较少,可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量,建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓,做到心中有数。


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